如何在安捷伦Seahorse XF HS迷你板中接种悬浮细胞

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Seahorse XF HS迷你板每孔可使用更少细胞进行XF分析,以便对非增殖细胞或数量有限的细胞进行功能分析。孔的接种面积为0.031平方厘米,约为标准XFp(或XFe96)细胞培养板接种面积的30%

XF HS迷你板为一块8孔细胞培养板,每个孔的中心有一个凸起的环状元件(1A)XF HS迷你板经过组织培养处理和γ射线照射,并包被多聚-D-赖氨酸。每块XF HS迷你板均预装有硅胶细胞接种遮罩和板盖。每包还配有一个遮罩拆卸工具(1B)

本文将介绍在安捷伦XF HS迷你板中接种悬浮细胞的流程。

1. (A) XF HS迷你板的环状元件圈出了更小的细胞接种区域。(B)每个板均预装有硅胶细胞接种遮罩、XF HS 迷你板板盖,以及可重复使用的遮罩拆卸工具

接种细胞

实验前一天

准备XF HS PDL迷你板:

1. 取出XF HS PDL迷你板,揭下密封箔,待用;

2. 将板放入无加湿CO2培养箱中37 °C过夜。

注:XF PDL HS迷你板与Agilent XFp迷你板托盘(部件号103057-100)兼容。

实验当天

XF PDL HS迷你板中接种细胞:

1. 从无CO2培养箱中取出板;

2. 在细胞培养孔周围的水槽中加入无菌水或PBS(2),将8通道移液器设为200 µL,填充两侧水槽(每个水槽容纳两个吸头),如果没有多通道移液器,向每个水槽中加入400 µL无菌水或PBS(3200 µL)

 

2.使用8通道移液器将溶液加入板孔两侧的水槽中。

3. 确定预期接种浓度,悬浮细胞的最佳细胞密度取决于细胞大小。通常情况下,最佳细胞密度应使细胞在孔中呈单层分布,汇合度为70%–90%XF HS迷你板中接种数量通常为每孔27万个细胞 (请参阅安捷伦细胞分析出版物数据库,根据细胞类型查找细胞接种密度建议,XF HS迷你板通常可容纳XFe96 XFp细胞培养板所需细胞数量的三分之一。)

4. 采用标准流程收集细胞。将细胞重悬于适当检测液中,计数,然后稀释至所需的接种浓度示例:收集和计数完成后,细胞浓度为 250万个细胞/mL,为达到预期接种浓度,稀释倍数为250个细胞/mL / 167万个细胞/mL = 1.5。对于一块XF HS板,将500 µL细胞与250 µL检测液混合;

5. 向孔B至孔G内的环状元件中加入30 µL细胞悬液,迅速平稳地压下推杆;

a. 建议将200 µL(或更小规格)移液吸头与硅胶遮罩配套使用;

b. 建议在XF HS迷你板中一次接种一个孔的细胞,移液吸头必须伸入孔底部以确保正确排液( 3)

3. 将移液吸头(蓝色轮廓)插入每个孔底部,排出细胞悬液。

6. A孔和H孔中加入30 µL检测液(不含细胞),作为背景校正孔。向板中加入细胞或检测液后,孔底部可能形成气泡(图4),这些气泡也许能够通过离心去除;

7. 200 × g离心5分钟,使细胞固定在孔底面;

4. (A)(离心前)标出的孔底部有一个气泡,(B)(离心后)气泡在离心过程中排出。

8. 使用遮罩拆卸工具取下遮罩;

a.一只手拿板,平放在实验台或工作台上,另一只手将工具插入板顶部和遮罩之间;

b.插入拆卸工具时,其尖头应与板的顶部保持平行;

c.请勿来回撬动以使工具插入更深,这一操作将产生吸力,并可能会干扰细胞层;

d.目标是一次性同时取下所有孔的遮罩;

e.工具完全插入时,撬动取下遮罩;

f.遮罩不会固定在尖头上,遮罩与板开始分离后,请用手指将遮罩固定在工具上,防止其掉落到板上;

g.板遮罩取下后请丢弃。

5. (A) 将拆卸工具的尖头插入每个孔之间,使工具底部与板顶部保持平行;(B) 尖头插入后,从板孔上撬动遮罩;(C) 从板里提起遮罩时,用一根手指将遮罩按在拆卸工具上,防止其掉落。

注:在取下硅胶遮罩的同时也会带出检测液。每个孔中将剩余20 µL左右的检测液。如果剩余量不一致,则仅需从孔的外环区域小心吸出,注意不要接触环内的细胞。请务必留下一些检测液来覆盖细胞。如有需要,调整步骤9添加的检测液的量。每个孔总体积的微小差异不会影响OCRECAR,但加样试剂的最终浓度可能会受到影响。

9. 向每个孔中加入160 µL检测液,以达到180 µL/孔的起始体积;

a. 确保细胞贴壁,呈均匀单层分布;

b. 确保背景校正孔中无细胞。

10. 将细胞板放入37 °CCO2培养箱中,待加载至分析仪。

声明:仅供研究使用,不用于诊断性操作。

版权说明:版权归原作者及安捷伦细胞团队,本文内容部分来源于美国安捷伦科技公司官网(www.agilent.com)。如有问题请联系小编,欢迎批评指正,衷心感谢!

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2021年6月4日 15:15
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